Kaninchen-Anti-Ziegen-IgG (H+L) Sekundärantikörper

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Hintergrund

Am häufigsten werden Sekundärantikörper durch Immunisierung des Wirtstiers mit einer gepoolten Population von Immunglobulinen der Zielspezies erzeugt. Das Wirtsantiserum wird dann mittels Immunoaffinitätschromatographie gereinigt, um alle Wirtsserumproteine außer dem spezifischen Antikörper von Interesse zu entfernen. Gereinigte Sekundärantikörper werden weiter mit Serumproteinen anderer Spezies festphasenadsorbiert, um Kreuzreaktivität in Gewebe- oder Zellpräparaten zu minimieren, und dann mit Antikörperfragmentierung, Markierungskonjugation usw. modifiziert, um hochspezifische Reagenzien zu erzeugen. Sekundärantikörper können an eine große Anzahl von Markierungen konjugiert werden, darunter Enzyme, Biotin und fluoreszierende Farbstoffe/Proteine. Hier liefert der Antikörper die Spezifität, um das Protein von Interesse zu lokalisieren, und die Markierung erzeugt ein detektierbares Signal. Die Wahl der Markierung hängt von der experimentellen Anwendung ab.

Biotinylierte Antikörper werden häufig in Systemen eingesetzt, bei denen eine Signalverstärkung erwünscht ist. Oft werden 15-20 Biotin-Motive an einen einzelnen IgG-Sekundärantikörper gekoppelt. Biotin bindet Avidin, Streptavidin oder Neutravidin mit einem hohen Grad an Affinität und Spezifität. In Immunoassays wird die Avidin/Streptavidin-Biotin-Bindung als Brücke zwischen Antikörpern und Reportern wie Enzymen (HRP, AP), Fluorophoren, Chromophoren usw. verwendet. Sowohl Avidin als auch Streptavidin sind tetramere Proteine, die in der Lage sind, 4 Biotin-Gruppen an jedes Molekül von Avidin oder Streptavidin zu binden, wodurch die Signalintensität und Detektionsempfindlichkeit durch Erhöhung der Reporterkonzentration am antigenen Ort verstärkt werden. Zwei Haupt-Biotin-bindende Detektionssysteme wurden weit verbreitet eingesetzt: die Avidin-Biotin-Komplex (ABC)- und die Labeled Streptavidin Biotin (LSAB)-Methoden. Bei der ABC-Methode wird freies Avidin (oder Streptavidin) als Brücke/Verbindung zwischen dem biotinylierten Antikörper und einem biotinylierten Reportermolekül verwendet, was zu drei Reportermolekülen führt, die an den biotinylierten Antikörper gekoppelt sind. Die LSAB-Methode verwendet ein Reporter-markiertes Streptavidin (Avidin oder Neutravidin kann alternativ verwendet werden), um den gebundenen biotinylierten Sekundärantikörper auf dem Gewebeschnitt, der Blotting-Membran oder der ELISA-Platte nachzuweisen, wodurch die Detektionsempfindlichkeit um das 8-fache verbessert wird. Die LSAB-Methode wird verwendet, wenn der Avidin-Biotin-Enzym-Komplex in der ABC-Methode zu groß wird, um in das Gewebe einzudringen.

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