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Die häufigsten Ursachen für Ergebnisse ohne Bande sind:

• Primer-Fehler — überprüfen Sie den Tm, den GC-Gehalt (40–60 %) und stellen Sie sicher, dass die Primer keine Dimere bilden
• Abgebautes Template — führen Sie das Template auf einem Gel aus, um die Integrität zu bestätigen; A260/A280 sollte 1,8–2,0 betragen
• Inhibitoren im Template — die Verschleppung von Ethanol, Phenol oder EDTA kann die Polymerase blockieren
• Falsche Mg²⁺-Konzentration — Standard ist 1,5 mM; titrieren Sie 1,0–3,0 mM
• Zu hohe Annealing-Temperatur — versuchen Sie, diese in Schritten von 5 °C zu reduzieren

Unspezifische Amplifikation wird normalerweise durch geringe Annealing-Stringenz oder Fehlpriming verursacht.

• Erhöhen Sie die Annealing-Temperatur schrittweise um 2 °C, bis unspezifische Banden verschwinden
• Verwenden Sie eine Hot-Start-Polymerase, um eine Extension bei Raumtemperatur zu verhindern
• Reduzieren Sie die Matrizenkonzentration – Überladung führt zu unspezifischen Produkten
• Fügen Sie 5 % DMSO oder Betain für GC-reiche Zielsequenzen hinzu

Für die meisten qPCR-Assays sind 1–10 ng cDNA oder genomischer DNA pro 20 µL Reaktion optimal. Eine Überladung (> 100 ng) führt zu Inhibition und künstlich hohen Cq-Werten. Eine Unterladung (< 0,01 ng) erhöht die Variabilität zwischen den Replikaten.

Führen Sie immer eine Standardkurve über 4–5 logarithmische Verdünnungen durch, um die Reaktionseffizienz zu überprüfen (90–110 % akzeptabel). Die Effizienz wird berechnet als: E = (10^(–1/Steigung)) – 1.

Ein schwaches Signal deutet typischerweise auf eine der folgenden Ursachen hin:

• Reagenzienablaufdatum überschritten oder Schäden durch Einfrieren und Auftauen – Chargendaten prüfen; wiederholtes Einfrieren und Auftauen von Antikörpern vermeiden
• Unzureichende Inkubationszeit oder -temperatur – sicherstellen, dass die Platte die richtige Temperatur hat und die Inkubation nicht verkürzt wird
• Substrat nicht aktiviert – TMB-Substrat sollte vor Gebrauch Raumtemperatur haben
• Probenkonzentration zu niedrig – sicherstellen, dass die Probe innerhalb des Standardkurvenbereichs liegt; bei Bedarf konzentrieren

Mykoplasmen sind die häufigsten Zellkulturkontaminanten und mit bloßem Auge oder einem Standard-Hellfeldmikroskop nicht sichtbar. Nachweismethoden:

• PCR-basierter Nachweis — am empfindlichsten; das ABMIUM Mykoplasmen-Nachweis-Kit (Kat.-Nr. AB-MYC-01) weist > 90 Spezies nach
• DAPI-/Hoechst-Färbung — Mykoplasmen erscheinen als kleine fluoreszierende Punkte um die Zellkerne

Zur Eliminierung ist eine BM-Cyclin-Behandlung über zwei 7-Tage-Zyklen für die meisten Stämme wirksam. Bestätigen Sie die Eliminierung 2 Wochen nach der Behandlung.