Warum die Hälfte der Forschungsantikörper versagt – und wer dafür verantwortlich ist
Die Reproduzierbarkeitskrise hat ein Reagenzproblem in ihrem Zentrum. Aber die Schuld auf den Antikörper zu schieben, übersieht das tiefere Problem: ein System, in dem Leistungsangaben selten unabhängig getestet werden, bevor Produkte Ihr Labor erreichen.
Jeder Forscher hat eine Geschichte. Der Antikörper, der in einem Labor eine wunderschöne Bande produzierte und in einem anderen nichts als Hintergrund. Der ELISA-Kit, der Ablesungen drei Standardabweichungen über dem Referenzbereich ergab. Die immunhistochemische Färbung, die jede Zelle im Schnitt aufleuchten ließ, unabhängig davon, ob das Zielprotein vorhanden war.
Dies sind keine seltenen Einzelfälle. Eine Analyse aus dem Jahr 2015 schätzte, dass etwa 50 % der weltweiten Ausgaben für proteinbindende Reagenzien aufgrund unspezifischer und inkonsistenter Antikörper verschwendet werden, eine Zahl, die sich in den zehn Jahren seither nicht wesentlich verbessert hat. Eine separate Studie ergab, dass nur die Hälfte von 5.436 kommerziellen Antikörpern von 51 Anbietern selbst grundlegende Validierungen mittels Western Blot und Immunhistochemie bestanden.
51 % der Forscher berichten über fehlgeschlagene Experimente aufgrund der Reagenzqualität
28.000 $ geschätzter jährlicher Reagenzienverlust pro Labor (US-Präklinische Forschung)
70 % der Angaben zur Antikörperleistung wurden nie unabhängig überprüft
Das Problem ist strukturell, nicht zufällig.
Es wäre einfach, dies als Versagen der Qualitätskontrolle darzustellen, als ob einige Lieferanten Abstriche machen, einige Chargen durch die Maschen fallen. Die Realität ist unbequemer. Das System selbst verlangt keine unabhängige Validierung von Leistungsangaben, bevor ein Produkt auf den Markt kommt. Ein Lieferant kann einen Antikörper als validiert für Western Blot, IHC und Durchflusszytometrie auflisten, basierend auf Daten, die vollständig intern generiert wurden, ohne externe Überprüfung der Methodik, Zelllinienauswahl oder verwendeten Kontrollen.
Dies ist nicht unbedingt unehrlich. Interne Validierungsdaten können rigoros sein. Aber sie sind auch werblich und werden von der Partei generiert, die am meisten von einem positiven Ergebnis profitieren kann. Wenn diese Daten die einzigen verfügbaren Daten sind und wenn sie auf einer Produktseite präsentiert werden, ohne jeglichen Hinweis darauf, wie sie generiert wurden oder wie viele Antikörper getestet und verworfen wurden, hat der Forscher keine wirkliche Vergleichsbasis.
„Der Forscher hat keine wirkliche Vergleichsbasis, nur ein Datenblatt, einen Preis und die Hoffnung, dass die gezeigten Bilder repräsentativ für das sind, was er an seinem Arbeitsplatz sehen wird.“
Was eine Validierung tatsächlich erfordert
Eine rigorose Antikörpervalidierung bedeutet mehr als nur einen Western Blot zu erstellen, der eine Bande mit dem richtigen Molekulargewicht zeigt. Die International Working Group for Antibody Validation (IWGAV) schlug fünf Säulen für die Validierung vor: genetische Strategien (Knockout-Zelllinien), orthogonale Methoden (Vergleich von Antikörperdaten mit RNA-Expressionsdaten), unabhängige Antikörper (Testen von zwei Antikörpern gegen dasselbe Ziel), Expression markierter Proteine und Immunkaptur gefolgt von Massenspektrometrie.
Sehr wenige kommerziell erhältliche Antikörper wurden anhand aller fünf Säulen validiert. Die meisten wurden anhand von ein oder zwei Säulen validiert, und die Wahl der Säule wird oft davon bestimmt, was am einfachsten zu zeigen ist, anstatt was für die beabsichtigte Anwendung am informativsten ist.
Anwendungsspezifität ist alles
Antikörper sind keine anwendungsunabhängigen Werkzeuge. Ein Antikörper, der in einem Western Blot, bei dem das Protein denaturiert und auf seine lineare Sequenz reduziert wird, hervorragend funktioniert, kann in der Durchflusszytometrie, bei der das Protein in seiner nativen Konformation gefaltet ist, überhaupt kein Signal erzeugen. Das in formalinfixiertem, paraffineingebettetem Gewebe zugängliche Epitop ist eine andere strukturelle Einheit als das in einer nicht-denaturierenden Immunpräzipitation zugängliche Epitop.
Dies bedeutet, dass Validierungsdaten aus einer Anwendung nur begrenzte Gewissheit über die Leistung in einer anderen Anwendung bieten. Dennoch listen Produktseiten routinemäßig mehrere validierte Anwendungen auf, ohne zwischen der Qualität der verfügbaren Beweise für jede einzelne zu unterscheiden.
Wessen Schuld ist es also?
Die Verantwortung liegt nicht allein bei den Lieferanten. Forscher, die publizieren, ohne anzugeben, welcher Antikörper verwendet wurde, in welcher Konzentration, in welcher Zelllinie, mit welchen Kontrollen, tragen zu einem System bei, in dem schlechte Daten nicht identifiziert und korrigiert werden können. Zeitschriften, die keine rigorose Antikörperberichterstattung verlangen, ermöglichen es, dass sich dasselbe Problem in Tausenden von Studien verschärft. Institutionen, die nicht in die Infrastruktur zur Reagenzienvalidierung investieren, überlassen es einzelnen Forschern, diese Validierung selbst durchzuführen, mit unterschiedlichem Fachwissen und Zeitaufwand.
Das Versagen ist verteilt. Eine Behebung erfordert Änderungen in der gesamten Lieferkette, einschließlich am Point-of-Purchase, wo Entscheidungen derzeit mit unvollständigen Informationen getroffen werden.
Was besser aussieht
Eine kleine, aber wachsende Zahl von Initiativen arbeitet daran, dies zu ändern. Das YCharOS (Antibody Characterization through Open Science) Projekt hat unabhängige Validierungsdaten für ausgewählte Antikörper unter Verwendung von Knockout-Zelllinien veröffentlicht und die Daten frei zugänglich gemacht. Mehrere Zeitschriften verlangen jetzt RRIDs (Research Resource Identifiers) für in Publikationen zitierte Antikörper. Und einige Lieferanten beginnen, zwischen internen Validierungen und unabhängig überprüften Leistungen zu unterscheiden, obwohl letzteres eher die Ausnahme als die Regel bleibt.
ABMIUM wurde mit der Prämisse aufgebaut, dass der Kauf mit Nachweisen die Norm sein sollte, nicht die Ausnahme. Die Vertrauensmatrix auf jeder Produktseite spiegelt unabhängig bewertete Leistungsdaten wider, nicht werbliche Behauptungen. Das ist eine kleine, aber bedeutende strukturelle Veränderung: Die Beweise werden dem Forscher vor der Kaufentscheidung vorgelegt, nicht nachdem das Experiment fehlgeschlagen ist.