Support technique
by Application Area

Les causes les plus fréquentes de l'absence de bande sont :

• Échec de l'amorce — vérifier la température de fusion (Tm), la teneur en GC (40-60 %) et s'assurer que les amorces ne forment pas de dimères
• Matrice dégradée — faire migrer la matrice sur gel pour en confirmer l'intégrité ; le rapport A260/A280 doit être de 1,8-2,0
• Inhibiteurs dans la matrice — la présence d'éthanol, de phénol ou d'EDTA peut bloquer la polymérase
• Concentration de Mg²⁺ incorrecte — la concentration standard est de 1,5 mM ; titrer entre 1,0 et 3,0 mM
• Température d'hybridation trop élevée — essayer de la réduire par paliers de 5 °C

Pour la plupart des analyses qPCR, 1 à 10 ng d'ADNc ou d'ADN génomique par réaction de 20 µL sont optimaux. Une surcharge (> 100 ng) provoque une inhibition et des valeurs Cq artificiellement élevées. Une sous-charge (< 0,01 ng) augmente la variabilité inter-réplicats.

Exécutez toujours une courbe standard sur 4 à 5 dilutions log pour vérifier l'efficacité de la réaction (90 à 110 % acceptable). L'efficacité est calculée comme suit : E = (10^(–1/pente)) – 1.

Un signal faible indique généralement l'une des causes suivantes :

• Péremption du réactif ou dommages dus à la congélation/décongélation — vérifiez les dates de lot ; évitez les congélations/décongélations répétées des anticorps
• Temps ou température d'incubation insuffisants — assurez-vous que la plaque est à la bonne température et que l'incubation n'est pas interrompue prématurément
• Substrat non activé — le substrat TMB doit être à température ambiante avant utilisation
• Concentration de l'échantillon trop faible — assurez-vous que l'échantillon se situe dans la plage de la courbe étalon ; concentrez si nécessaire

Le mycoplasme est le contaminant de culture cellulaire le plus répandu et est invisible à l'œil nu ou à la microscopie optique standard. Méthodes de détection :

• Détection par PCR — la plus sensible ; le kit de détection de mycoplasmes ABMIUM (réf. AB-MYC-01) détecte plus de 90 espèces
• Coloration DAPI/Hoechst — les mycoplasmes apparaissent comme de petits points fluorescents autour des noyaux

Pour l'élimination, un traitement au BM-Cyclin sur deux cycles de 7 jours est efficace pour la plupart des souches. Confirmer l'élimination 2 semaines après le traitement.